In generale per cromatografia si intende un insieme di tecniche e metodi che permettono di separare una miscela complessa di molecole. HPLC è una tecnica cromatografica basata su un fase stazionaria solida impaccata in una colonna e una fase mobile fatta flussare grazie a delle pompe attraverso la colonna. La differenza rispetto ad altre cromatografie liquide, è l’utilizzo di elevate pressioni nella colonna che permettono di separare miscele molto complesse in poco tempo. Il campione che si vuole separare è  miscelato alla fase mobile e quindi trasportato in colonna a contatto con la fase stazionaria. La molecola a seconda della sua struttura chimica possiederà una diversa “affinità” per la fase mobile e per la fase stazionaria. Maggiore è l’affinità per la fase stazionaria, maggiore è il tempo che la molecola ci metterà ad uscire dalla colonna. Il tempo impiegato dalla molecola ad uscire dalla colonna è chiamato tempo di ritenzione.

Il cuore di un sistema HPLC sono le colonne e la fase stazionaria impaccata al suo interno. Normalmente queste colonne hanno una lunghezza variabile tra i 10 e i 25 cm, anche se ultimamente vengono prodotte colonne sempre più corte intorno ai 3 cm. Nelle biotecnologie spesso l’HPLC viene utilizzata per separare una miscela proteica complessa,  in questo caso la fase stazionaria possiederà diverse proprietà chimiche a seconda della tipologia di separazione che si vuole effettuare.

Cromatografia a fase inversa: In questa cromatografia abbiamo una fase stazionaria apolare (di natura idrofobica non solubile in acqua) e una fase mobile polare (di solito una miscela di Acqua e metanolo). Questa cromatografia permette di separare le proteine in base alla polarità ed inoltre a seconda della lunghezza delle catene idrofobiche della fase stazionaria è possibile separare proteine di diversa grandezza. Le colonne C4 possiedono una corta catena composta da 4 atomi di carbonio e sono più adatte alla separazione di grosse proteine, invece le colonne C18 con una catena idrofobia di 18 atomi di carbonio è più adatta alla separazione di piccole proteine o peptidi.

Cromatografia a scambio ionico: in questa cromatografia abbiamo una fase stazionaria caricata positivamente o negativamente, in questo modo la fase stazionaria avrà affinità per molecole con carica netta opposta (positiva o negativa). Chiaramente questo tipo di cromatografia sarà molto influenzato dal pH della fase mobile, perché la carica netta delle molecole da separare è influenzato dal pH del solvente in cui è disciolta. pH acidi permetteranno di ionizzare positivamente le molecole, invece pH basici caricheranno negativamente le molecole da separare.

Cromatografia ad esclusione: In questa cromatografia si separano molecole in base alla loro grandezza e non in base alla affinità con la fase stazionaria. Infatti i materiali utilizzati per la fase stazionaria sono inerti (non interagiscono) verso i campioni biologici. In pratica, le molecole piccole riusciranno a passare attraverso gli stretti cunicoli tra le diverse particelle che costituiscono la resina, invece le molecole più grandi non riusciranno a passare da questi spazi e quindi verrano escluse e usciranno più velocemente perché non dovranno passare all’interno della resina.

Cromatografia di affinità: Questa cromatografia è molto utilizzato nell’ambito delle biotecnologie, alla fase stazionaria vengono legati degli anticorpi in grado di catturare solo specifiche molecole. In questo modo è possibile isolare e purificare una singola proteina all’interno di una miscela complessa di altre proteine.

In una HPLC in uscita dalla colonna cromatografia è presente un rilevatore che permette di “rilevare” le molecole in uscita, e quindi di valutare se la miscela che è stata iniettata è stata adeguatamente separata.

Specifiche generali
Display	Alfanumerico a 2 righe, 40 caratteri per riga/, display LCD, con retroilluminazione a LED gialla o ambra.
Diagnostica	Auto – Test e diagnostica incorporati automatici all’accensione
Programmazione con il tempo	Programmabili nel tempo: lunghezza d’onda, attenuazione del recorder, autozero, peaksense, timeslice, pulse, e relay di eventi esterni. Memorizzazione di massimo 5 metodi con protezione della memoria in caso di interruzione di corrente.
Lunghezza d’onda	Lampada al deuterio e filtro di secondo ordine controllato automaticamente, intervallo 190-700 nm
Cella di flusso	Volume di 15 µL, percorso ottico di 8 mm
Cella di flusso opzionale	Volume di 4.5 µL, percorso ottico di 4 mm
Costante di tempo	0.05 , 0.5, 1.0, e 5.0 selezionabile da tastiera
Ampiezza dalla banda passante spettrale	5 nm
Uscita registratore	Intervalli di assorbanza selezionabili ( 0.001, 0.002, 0.005, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0 e 2.0 . UA = 1 mV o 10 mV (Selezione con commutatore)
Uscita Dati	2 UA = 1 Volt o 10 Volt (selezionabile dal pannello posteriore)
Gestione picchi	Inizio, Fine,  lasso di tempo, e pulse attiveranno il relay Peaksense (Sensibilità picco) e genereranno i segni evento sul grafico del registratore.
Controllo esterno e comunicazione	Da Workstation tramite GPIB ed ad altri strumenti tramite cavo di sincronizzazione.
Uscite chiusure di contatti	4 relay per eventi esterni programmabili nel tempo, un relay del Peaksense (Sensibilità picco,  tre segnali di sincronizzazione: READY OUT, START OUT, e FAULT OUT.
Ingressi chiusure di contatti	Tre segnali di sincronizzazione: READY IN, START IN, e FAULT IN
Bus di comunicazione	Comunicazione con la Workstation LC Star 9020 per mezzo dell’interfaccia IEEE488 Bus (GPIB).
Specifiche di prestazione
Noise	0.02 mUA (Unità di assorbanza) picco – picc a 2409 nm, costante di tempo 1 sec,  flusso di metanolo di 1 mL/min, usando la cella a flusso continuo da 15µL/8 mm
Deriva	Minore di 1 UA/ora dopo il tempo di preriscaldamento (warm – up). La variazione massima della  temperatura dell’aria ambiente deve essere massimo di 1°C per ora.
Linearità	1% ad 1.5 UA a 265 nm con acetone in acqua.
Sensibilità all’indice di rifrazione	Deriva della linea di base di 2 mUA tra metanolo e acqua a 350 nm
Specifiche fisiche
Larghezza	29.2 cm (11.5”)
Profondità	56.0 cm (22.0”)
Altezza	29.2 cm (11.5”)
Peso alla spedizione	23.2 Kg (51.25 libbre)
Requisiti di Alimentazione elettrica	108 – 132 Vac (120 ±10%), 50/60 Hz a fase singola, 198-242 Vac (220 ± 10%), 50/60 Hz a fase singola, o 220 Vac, 50/60 Hz, a due fasi (fase /fase)salvo diversamente specificato. Il modulo 9050 è dotato di selettore di tensione che permette il funzionamento alle tensioni ed alle frequenze su specificate.
Consumo di corrente	170 VA
Condizioni ambientali	Funzionamento secondo le specifiche nell’intervallo di temperatura 10÷35°C e di umidità 5%÷95%, funzionamento senza avarie nell’intervallo 0÷50°C, mentre la conservazione ottimale è assicurata a temperature comprese tra -20°C e 65°C

Caratteristiche pompa

Uscite chiusure di contatti	6 relay per eventi esterni programmabili nel tempo, e  tre segnali di sincronizzazione: READY OUT, START OUT, e FAULT OUT.
Ingressi chiusure di contatti	Tre segnali di sincronizzazione: READY IN, START IN, e FAULT IN
Bus di comunicazione	Comunicazione con la Workstation LC Star 9020 per mezzo dell’interfaccia IEEE488 Bus (GPIB).
Specifiche di prestazione
Max pressione di esercizio	da 1 a 410 atmosfere. (6000 psi)
Velocità del flusso dell’eluente	da 0.010 a 10.0 mL/min ad incrementi di 0.01mL/min, tra 0.00 e 1.00 mL/min, ed incrementi di  0.1 mL/min tra 1.0 e 10.0 mL/min.
Precisione del flusso	Lo 0.1%  di RSD (Deviazione Standard) a 1 mL/min per una miscela metanolo/acqua.
Accuratezza del flusso	± 0.5% con un flusso di alcool isopropilico ad 1 mL/min
Pulsazioni di pressione	Minore del 2% a 150 atmosfere (con un flusso di alcool isopropilico ad 1 mL/min)
Specifiche fisiche
Larghezza	29.2 cm (11.5”)
Profondità	56.0 cm (22.0”)
Altezza	29.2 cm (11.5”)
Peso alla spedizione	27. 7 Kg (61 libbre)
Requisiti di Alimentazione elettrica	108 – 132 Vac (120 ±10%), 50/60 Hz a fase singola, 198-242 Vac (220 ± 10%), 50/60 Hz a fase singola, o 220 Vac, 50/60 Hz, a due fasi (fase /fase)salvo diversamente specificato. Il modulo 9002 è dotato di selettore di tensione che permette il funzionamento alle tensioni ed alle frequenze su specificate.
Consumo di corrente	160 VA
Condizioni ambientali	Funzionamento secondo le specifiche nell’intervallo di temperatura 10÷35°C,  e di umidità 5%÷95%. Conservazione ottimale a temperature comprese tra -20°C e 65°C.