In generale per cromatografia si intende un insieme di tecniche e metodi che permettono di separare una miscela complessa di molecole. HPLC è una tecnica cromatografica basata su un fase stazionaria solida impaccata in una colonna e una fase mobile fatta flussare grazie a delle pompe attraverso la colonna. La differenza rispetto ad altre cromatografie liquide, è l’utilizzo di elevate pressioni nella colonna che permettono di separare miscele molto complesse in poco tempo. Il campione che si vuole separare è miscelato alla fase mobile e quindi trasportato in colonna a contatto con la fase stazionaria. La molecola a seconda della sua struttura chimica possiederà una diversa “affinità” per la fase mobile e per la fase stazionaria. Maggiore è l’affinità per la fase stazionaria, maggiore è il tempo che la molecola ci metterà ad uscire dalla colonna. Il tempo impiegato dalla molecola ad uscire dalla colonna è chiamato tempo di ritenzione.
Il cuore di un sistema HPLC sono le colonne e la fase stazionaria impaccata al suo interno. Normalmente queste colonne hanno una lunghezza variabile tra i 10 e i 25 cm, anche se ultimamente vengono prodotte colonne sempre più corte intorno ai 3 cm. Nelle biotecnologie spesso l’HPLC viene utilizzata per separare una miscela proteica complessa, in questo caso la fase stazionaria possiederà diverse proprietà chimiche a seconda della tipologia di separazione che si vuole effettuare.
Cromatografia a fase inversa: In questa cromatografia abbiamo una fase stazionaria apolare (di natura idrofobica non solubile in acqua) e una fase mobile polare (di solito una miscela di Acqua e metanolo). Questa cromatografia permette di separare le proteine in base alla polarità ed inoltre a seconda della lunghezza delle catene idrofobiche della fase stazionaria è possibile separare proteine di diversa grandezza. Le colonne C4 possiedono una corta catena composta da 4 atomi di carbonio e sono più adatte alla separazione di grosse proteine, invece le colonne C18 con una catena idrofobia di 18 atomi di carbonio è più adatta alla separazione di piccole proteine o peptidi.
Cromatografia a scambio ionico: in questa cromatografia abbiamo una fase stazionaria caricata positivamente o negativamente, in questo modo la fase stazionaria avrà affinità per molecole con carica netta opposta (positiva o negativa). Chiaramente questo tipo di cromatografia sarà molto influenzato dal pH della fase mobile, perché la carica netta delle molecole da separare è influenzato dal pH del solvente in cui è disciolta. pH acidi permetteranno di ionizzare positivamente le molecole, invece pH basici caricheranno negativamente le molecole da separare.
Cromatografia ad esclusione: In questa cromatografia si separano molecole in base alla loro grandezza e non in base alla affinità con la fase stazionaria. Infatti i materiali utilizzati per la fase stazionaria sono inerti (non interagiscono) verso i campioni biologici. In pratica, le molecole piccole riusciranno a passare attraverso gli stretti cunicoli tra le diverse particelle che costituiscono la resina, invece le molecole più grandi non riusciranno a passare da questi spazi e quindi verrano escluse e usciranno più velocemente perché non dovranno passare all’interno della resina.
Cromatografia di affinità: Questa cromatografia è molto utilizzato nell’ambito delle biotecnologie, alla fase stazionaria vengono legati degli anticorpi in grado di catturare solo specifiche molecole. In questo modo è possibile isolare e purificare una singola proteina all’interno di una miscela complessa di altre proteine.
In una HPLC in uscita dalla colonna cromatografia è presente un rilevatore che permette di “rilevare” le molecole in uscita, e quindi di valutare se la miscela che è stata iniettata è stata adeguatamente separata.
Specifiche generali | |
Display | Alfanumerico a 2 righe, 40 caratteri per riga/, display LCD, con retroilluminazione a LED gialla o ambra. |
Diagnostica | Auto – Test e diagnostica incorporati automatici all’accensione |
Programmazione con il tempo | Programmabili nel tempo: lunghezza d’onda, attenuazione del recorder, autozero, peaksense, timeslice, pulse, e relay di eventi esterni. Memorizzazione di massimo 5 metodi con protezione della memoria in caso di interruzione di corrente. |
Lunghezza d’onda | Lampada al deuterio e filtro di secondo ordine controllato automaticamente, intervallo 190-700 nm |
Cella di flusso | Volume di 15 µL, percorso ottico di |
Cella di flusso opzionale | Volume di 4.5 µL, percorso ottico di |
Costante di tempo | 0.05 , 0.5, 1.0, e 5.0 selezionabile da tastiera |
Ampiezza dalla banda passante spettrale | 5 nm |
Uscita registratore | Intervalli di assorbanza selezionabili ( 0.001, 0.002, 0.005, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0 e 2.0 . UA = 1 mV o 10 mV (Selezione con commutatore) |
Uscita Dati | 2 UA = 1 Volt o 10 Volt (selezionabile dal pannello posteriore) |
Gestione picchi | Inizio, Fine, lasso di tempo, e pulse attiveranno il relay Peaksense (Sensibilità picco) e genereranno i segni evento sul grafico del registratore. |
Controllo esterno e comunicazione | Da Workstation tramite GPIB ed ad altri strumenti tramite cavo di sincronizzazione. |
Uscite chiusure di contatti | 4 relay per eventi esterni programmabili nel tempo, un relay del Peaksense (Sensibilità picco, tre segnali di sincronizzazione: READY OUT, START OUT, e FAULT OUT. |
Ingressi chiusure di contatti | Tre segnali di sincronizzazione: READY IN, START IN, e FAULT IN |
Bus di comunicazione | Comunicazione con |
Specifiche di prestazione | |
Noise | 0.02 mUA (Unità di assorbanza) picco – picc a 2409 nm, costante di tempo 1 sec, flusso di metanolo di 1 mL/min, usando la cella a flusso continuo da 15µL/8 mm |
Deriva | Minore di 1 UA/ora dopo il tempo di preriscaldamento (warm – up). La variazione massima della temperatura dell’aria ambiente deve essere massimo di |
Linearità | 1% ad 1.5 UA a 265 nm con acetone in acqua. |
Sensibilità all’indice di rifrazione | Deriva della linea di base di 2 mUA tra metanolo e acqua a 350 nm |
Specifiche fisiche | |
Larghezza | |
Profondità | |
Altezza | |
Peso alla spedizione | |
Requisiti di Alimentazione elettrica | 108 – 132 Vac (120 ±10%), 50/60 Hz a fase singola, 198-242 Vac (220 ± 10%), 50/60 Hz a fase singola, o 220 Vac, 50/60 Hz, a due fasi (fase /fase)salvo diversamente specificato. Il modulo 9050 è dotato di selettore di tensione che permette il funzionamento alle tensioni ed alle frequenze su specificate. |
Consumo di corrente | 170 VA |
Condizioni ambientali | Funzionamento secondo le specifiche nell’intervallo di temperatura 10÷35°C e di umidità 5%÷95%, funzionamento senza avarie nell’intervallo 0÷50°C, mentre la conservazione ottimale è assicurata a temperature comprese tra |
Caratteristiche pompa
Uscite chiusure di contatti | 6 relay per eventi esterni programmabili nel tempo, e tre segnali di sincronizzazione: READY OUT, START OUT, e FAULT OUT. |
Ingressi chiusure di contatti | Tre segnali di sincronizzazione: READY IN, START IN, e FAULT IN |
Bus di comunicazione | Comunicazione con |
Specifiche di prestazione | |
Max pressione di esercizio | da |
Velocità del flusso dell’eluente | da |
Precisione del flusso | Lo 0.1% di RSD (Deviazione Standard) a 1 mL/min per una miscela metanolo/acqua. |
Accuratezza del flusso | ± 0.5% con un flusso di alcool isopropilico ad 1 mL/min |
Pulsazioni di pressione | Minore del 2% a 150 atmosfere (con un flusso di alcool isopropilico ad 1 mL/min) |
Specifiche fisiche | |
Larghezza | |
Profondità | |
Altezza | |
Peso alla spedizione | 27. |
Requisiti di Alimentazione elettrica | 108 – 132 Vac (120 ±10%), 50/60 Hz a fase singola, 198-242 Vac (220 ± 10%), 50/60 Hz a fase singola, o 220 Vac, 50/60 Hz, a due fasi (fase /fase)salvo diversamente specificato. Il modulo 9002 è dotato di selettore di tensione che permette il funzionamento alle tensioni ed alle frequenze su specificate. |
Consumo di corrente | 160 VA |
Condizioni ambientali | Funzionamento secondo le specifiche nell’intervallo di temperatura 10÷35°C, e di umidità 5%÷95%. Conservazione ottimale a temperature comprese tra |
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